Hur du optimerar Protein Expression

Ändringar i bakterietillväxtbetingelserkan förbättra proteinuttryck . experiment bild av martin Schmid från Fotolia.com

Protein uttryck är den process där information kodas i generna översätts till ett protein.I sina värdar, är många proteiner produceras i mängder som är alltför låg för studier i labbet.Därför forskare använder olika tekniker för att överuttrycka proteiner i syfte att producera en tillräcklig mängd tillräckligt för rening och karaktärisering.Gener av intresse infogas i expressionsvektorer (vanligen från pET-expressionssystemet), som är DNA-molekyler som kan replikera separat från kromosomalt DNA.Dessa vektorer införs sedan i en bakteriecell, vanligtvis en stam av Escherichia coli, för tillväxt och överexpression.Om du har tur, kommer din protein överuttrycker efter enkel odling över natten i ett odlingsmedium, men denna process kräver ofta felsökning för att få optimala uttrycksnivåer.

Du behöver

  • Luria-Bertani (LB) buljong
  • en stam av bakterier för tillväxt
  • Kolvar eller rör för att hålla bakteriekulturer
  • Spektrofotometer
  • Pipetter
  • 1,5 ml Eppendorf-rör
  • isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid (IPTG)
  • Sackaros
  • Flask skakapparat med temperaturkontroll
  • en procent n-oktyl-beta-D-tioglukopyranosid (OTG)
  • Bords centrifug

Optimera Tillväxt Tid och temperatur

  1. Förbered två eller flera fem milliliter (ml) kulturer av ditt protein genom tillsats av en bakteriekoloni från en agarplatta innehållande ditt protein till en 5-ml prov av LB-medium.Väx kulturer över natten med skakning vid 37 Celsius.

  2. Tillsätt 500 mikroliter av varje odling över natten till en separat kultur innehållande 50 ml LB nästa morgon och placera dem i en skakapparat vid 37 Celsius.

  3. Låt kulturer att växa tills absorbansen vid 600 nm når 0,6 (exponentiell tillväxtfas).Mät absorbansen med hjälp av en spektrofotometer tomt med LB-media.När absorbansen når 0,6, tillåta kulturer växa under olika tidpunkter.Föreslagna tidpunkter är 3 timmar, 6 timmar, 12 timmar, 18 timmar och 24 timmar.

  4. Kontrollera absorbansen efter varje tidpunkt och spara prover av lika celldensitet för varje kultur i en 1,5 ml Eppendorf-rör.Som referens motsvarar en absorbans av 1 vid 600 nm, typiskt till en celldensitet av cirka 10 ^ 9 celler / ml.Justera hur mycket av varje prov du sparar enligt absorbansen.

  5. Upprepa stegen ovan men i stället för att försöka olika tidpunkter, prova olika temperatur genom att placera 50 ml kulturer i shakers av olika temperaturer när absorbansen når 0,6.Föreslagna temperaturer är 37 ° C, 30 ° C, 21 ° C eller 18 ° Celsius.Låt växa under en tid som du väljer.Upprepa insamling av prover som beskrivs i steg 4.

Användning av Inducerare

  1. Förbered kulturer som beskrivs i avsnitt 1, steg 1 och 2.

  2. Lägg IPTG till en slutlig koncentration av 1 millimolar till en kulturnär absorbansen vid 600 nm når 0,6.PET-expressionssystemet kontrolleras av lac-promotorn, som är platsen där RNA-polymeras binder för att påbörja gentranskription.IPTG förskjuter lac-repressorn, ett DNA-bindande protein som binder nära promotorn och förhindrar RNA-polymeras fastsättning.Förskjutning av repressorn medger bindning av RNA-polymeras och gentranskription.

  3. Lägg 5 procent sackaros till en kultur efter absorbansen har nått 0,6.Sackaros är en kolkälla för bakterietillväxt.

  4. Lägg både IPTG och sackaros till en tredje kultur.Du kommer nu att ha minst 4 kulturer: en med ingenting sattes till en kontroll, en med IPTG, en med sackaros tillsattes och en med både IPTG och sackaros tillsättes.

  5. Låt kulturer att växa under en tid och vid en temperatur som du väljer och samla prover som beskrivs i avsnitt 1, Steg 4.

Analys av uttrycksnivåer

  1. Centrifugera alla insamlade prover vid maximal hastighet ien bordscentrifug.Kasta flytande, lämnar pellet i botten av röret.

  2. Resuspendera bakterie pellets i en procent OTG, ett rengöringsmedel som bryter ned celler.

  3. Kör en SDS-PAGE-gelanalys på alla insamlade prover och övervaka uttrycksnivåer av ditt protein i varje prov.Tillväxt tillstånd som producerar mest proteinuttryck är det som du ska använda för fullskalig tillväxt, rening och karakterisering av ditt protein.

Ytterligare optimering

  1. Vary typer av media om uttrycket är fortfarande svårt.Alternativa alternativ inkluderar Super Broth och Terrific Broth.

  2. Vary bakteriestammar cell om uttrycket är fortfarande svårt.Vanliga stammar av E. coli som används för expression namnges BL21 (DE3) och JM 109 och är kända för att överuttrycka proteiner väl.

  3. testa olika kombinationer av tillväxttiden, temperaturen, och induktion vid behov.Dessa kan också provas i olika tillväxtmedier och bakteriestammar.

Tips & amp;Varningar

  • Det kan vara nödvändigt att späda varje prov innan absorbansen om värdena är för höga för din spektrofotometer för att mäta exakt.En tiofaldig spädning rekommenderas genom att ta 100 mikroliter av din kultur och lägga 900 mikroliter LB-medium.Var noga med att redogöra för spädningsfaktorn när du sparar prover.
  • Bär alltid personlig skyddsutrustning vid arbete i ett laboratorium.Detta inkluderar en labbrock, skyddsglasögon och handskar.